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DNA產物純化常見問題分析 solarbio

更新時間:2010-10-24  |  點擊率:2264

 

DNA產物純化常見問題分析
 

常見問題
可能原因
建議解決方案
未回收或回收率低
膠塊未全部溶解
溶解凝膠時應該置于65℃水浴,不斷上下顛倒,確定膠塊*溶解后再進行下一步操作。如果凝膠濃度較大,可增加溶膠液使用量。
膠塊太大(>400mg)
如果需要處理的膠塊太大,應該先將其切成小塊,做兩次回收或選用大量型回收試劑盒。
電泳緩沖液pH過高
硅膠膜在高鹽低pH值時可結合DNA,在低鹽高pH值條件下洗脫。如果電泳緩沖液pH值太高,會導致DNA無法結合或降低結合率,可在溶膠后加入3M NaAc (pH5.2),將pH值調至7.0以下。
漂洗液中未加入無水乙醇
*次使用之前應該在漂洗液中加入無水乙醇。漂洗液每次用后應該擰緊瓶蓋,以免乙醇揮發(fā),降低回收率。
洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如TE和水;洗脫液pH值過低會降低洗脫效率,應確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間,當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內;洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70水浴預熱,加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘,可提高洗脫效率。
洗脫液加入位置不正確
洗脫液應加在硅膠膜中心部位,確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達到大洗脫效率。
洗脫體積太小
洗脫液體積若小于30μl,則不易*浸透硅膠膜,使洗脫效率降低;洗脫液體積若超過200μl,則所得的DNA濃度會降低,但DNA總量不會減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當增大洗脫液體積。
洗脫時間過短
洗脫時間對回收率也會有—定影響,洗脫時放置2分鐘可達到較好的效果。
回收后的片斷無法用于后續(xù)試驗,如連接等
乙醇殘留
洗脫時硅膠膜上有漂洗緩沖液殘留,會使洗脫產物中含乙醇,影響下游操作,在洗脫之前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘,*去除漂洗緩沖液中的乙醇。
洗出液中污染有瓊脂糖
凝膠未全部溶解
洗脫產物有ssDNA,表現為在瓊脂糖電泳上呈現小的彌散帶。
將洗脫產物95℃加熱2分鐘,慢慢冷卻到室溫,使單鏈DNA重新退火復性即可。